有关新冠病毒病原学存在的许多未解问题，目前还无法给出一个100分的答案。今天主要和大家交流新冠病毒从病原学的角度进行了哪些研究，这些研究给临床带来哪些提示，特别提到的是在病毒检测方面如何选择方法。从2005年开始，国内团队开展了系统的呼吸道病毒病原学研究，积累了核酸、抗体等检测方法和经验，在新冠病毒检测中这些技术能够在病原鉴定和病原学研究中充分发挥作用。

　　病原学的问题可总结为「六大问题」。第一个问题，它是谁？当发现一个不明原因肺炎或者其他的不明原因感染，它到底是由什么病原引发？

　　把发现过程整理成文章是重要的「复现」过程，实际上是展示完整的链条——如何确定新冠病毒就是疫情的病原体。这四篇文章中除了有一篇在早期发表，其他三篇文章都是按照要求在1月20日之后发表在各个杂志。当时国内有几个团队按照任务要求同时开展鉴定工作，很快就都锁定了一种新型冠病毒为此次疫情病原。知道它是谁，那么病毒通过何种方式感染细胞？感染哪些组织细胞？病毒传播过程中如何变化？人感染之后的症状是什么样？如何防治？我们针对上述几个问题逐一探讨。

　　十余年前，当我们遇到不明原因肺炎等疾病时，鉴定病原常是猜测排除法。近些年，分子检测技术不断发展，未知病原鉴定技术体系随之不断完善，如此次鉴定新冠病毒鉴定的团队均采用不同的深度测序技术快速获得病毒的基因组序列，结合病毒学经典的技术方法，即病毒的分离培养、病毒抗体和抗原等免疫学特征等来确定新冠病毒是感染病原体。体现在新冠病毒鉴定的文献里，能看到基因组序列特征、分离的病毒引起的细胞病变效应、病毒在电镜下的形态学特征，特异性抗体的产生等结果为鉴定依据。其中感染病例血清抗体特征以外周血抗体4倍增高为依据来判定是否有病毒感染等。这些方法都是病毒病原学研究常用的检测方法，在所有检测鉴定方法中分子检测仍是较快速的，可以帮助我们快速病毒筛查；病毒分离培养等病毒学上的「金标准」检测方法耗时长。

　　新冠病毒发现以后，从感染症状上来看，部分病人会出现严重急性呼吸综合征（SARS），据此命名为SARS-CoV-2。根据基因组序列特征，新冠病毒的组成与SARS等冠状病毒家族成员比较接近，从5端开始前2/3的区域都是编码病毒聚合酶的基因，后1/3是编码包括刺突蛋白（Spike, S）、包膜蛋白（Envelope, E）、膜蛋白（Membrane, M）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N）等病毒主要结构蛋白，在这些结构蛋白中穿插着小的开放读码框编码非结构蛋白，这些非结构蛋白是拮抗宿主天然免疫反应，诱导宿主焦亡或者凋亡的重要蛋白分子。

　　从发现新冠病毒以后，我们会看到很多通过自媒体或官方媒体等渠道发布的信息，如「某地方测了一条序列，已经证实为××」，这是非常不严谨的说法。要证实一个新发疾病病原，不是有点序列就可以判断，即使从基因组特征确认了新型冠状病毒基因序列的存在，判定其为感染病原但仍需遵循科赫法则。

　　对于新冠病毒来讲，我们团队与中国医学科学院医学实验动物研究所的老师合作，很快就把这一条链条形成一个闭环的证据全部拿到。从基因组与生物信息学的角度来看，我们知道这是冠状病毒序列，在细胞上分离出来新冠病毒，也可以明确其冠状病毒的形态，那它到底是不是致病病原呢？

　　这组实验，是在前面已经确定病毒基因组特征、分离到病毒的情况下，用病毒分离株感染转人类ACE2基因小鼠（hACE2小鼠），能够看到实验小鼠体重下降，肺部炎症的表现，病毒S蛋白和hACE2受体被发现共定位于肺泡上皮细胞，最关键的是从小鼠的感染组织中分离出新冠病毒，经过基因组测序与感染的毒株序列基本一致。这个过程在文章中是很简单的一张图片，但拿到一张满意的图片难度还是比较大，记得负责电镜检测的老师用了一个通宵拿到这张图片。上述提到的四点就是经典的科赫法则，我们把链条完美地呈现出来，就可以确定它就是导致新冠肺炎的病原。

　　上图为感染人类的冠状病毒的家族谱，图中红字都是可感染人冠状病毒。从1966年人冠状病毒229E和1967年人冠状病毒OC43发现以来六十余年时间，我们只认识2种可感染人冠状病毒。2003年的SARS-CoV出现，SARS之后的2004年，港大的袁国勇教授以及荷兰的学者发现两个新型可感染人冠状病毒，即HKU1、HCoV-NL63。随后，又过了约8年的时间，在2012年发现了MERS-CoV。在2019年，又出现了SARS-CoV-2。所有的人类冠状病毒都是跨种来源。2003年后由于溯源需要，在蝙蝠等野生动物体内鉴定出多种动物冠状病毒，能否从动物体内早期鉴定出可能感染人类的病毒，这是病原学研究中重点关注的内容。积累的冠状病毒基因组特征等数据也为后续寻找病毒演化特征提供了必备的基础参考数据。

　　在细胞里面会形成大量的囊泡样的状态。其实很多冠状病毒都会形成这样的囊泡样结构，这种囊泡的结构与病毒的致病机制密切相关。但是这方面的研究起步比较晚，现在还没有太大的进展。

　　从公开发表的文章时间轴上可以看到，首先我们要清楚新冠病毒如何感染人类，找到受体是我们做病原学研究中首要完成的工作。从早期发表的病原发现的文章中，对基因组特征的描述上，可从基因组成结构特征上预测受体类型，预测到新冠病毒可能会利用ACE2感染人类。很快国内的几个团队背靠背解析出这个结构，明确新冠病毒的受体就是ACE2，同时也都知道了TMPRSS2（跨膜丝氨酸蛋白酶）所起的作用。那么，新冠病毒是否存在其他的受体？

　　新冠病毒引起的肠道反应是既往在人感染冠状病毒中一直存在的，比如感染新冠病毒后引起的腹泻等。基于肠道类器官开展新冠病毒感染的研究，发现CD147可能是新冠病毒的受体，细胞实验发现阻断CD147可抑制病毒在肠道细胞和肺、肝脏、皮肤等来源的细胞上的复制。

　　病毒感染不同组织来源的培养细胞系，如果能形成有效的感染，提示其可能在感染过程中攻击相应的组织器官。这是做病毒病原学研究的关注点之一，体外细胞培养结果与组织细胞的嗜性并不是完全的一对一的关系，但至少会给我们一个提示可能的器官嗜性。

　　新冠病毒可以在肺腺癌Calu3细胞、肠腺癌的Caco2细胞、肝细胞癌的Huh7细胞上复制，还可以在肾脏细胞、神经系统来源的细胞上复制。这些容许新冠病毒复制的细胞，高度提示其在感染过程中的器官嗜性，对于理解病毒致病机制有重要提示作用。

　　组学技术手段的应用也进一步加速了对新冠病毒感染特征的认识，如大规模的单细胞测序、转录组测序、蛋白质组学筛选等方法，使我们能够在第一时间获得更全面数据来帮助我们去重新认识新冠病毒对感染的特点。这篇文章对36个组织进行转录组分析，分析哪些组织同时表达ACE2和TMPRSS2。表达丰度从高到低排序，肺部的AT2细胞、巨噬细胞等表达量较高。

　　此外，在全身的各个组织脏器上也都分布有这两种病毒复制相关的关键宿主因子，如心肌细胞、肾上腺和的基质细胞等。大数据线索还有哪些提示呢？病毒使用的受体也是生理活动下必需的宿主因子，受体高表达区域可能对病毒嗜性器官具有提示作用，但需要注意细胞类型和组织分布部位，是否自然感染状态下病毒能够直接接触到这些细胞。此外，要考虑是否有病毒血症，病毒可通过二次体内分布攻击各个器官。COVID-19病人临床表现具有心脏受损、肾脏受损等多器官功能损伤，重症病人血液中可检测到病毒核酸，提示存在病毒血症，而上述容易出现功能受损器官的组织细胞上有ACE2等受体的表达，提示病毒可能通过血液、体液等导致全身多脏器的直接损伤。

　　对ACE2等受体分布特征的研究也外展到宠物、野生动物、家禽等不同物种，对病毒受体表达特征的研究，发现猫的AT2细胞、成纤维细胞、杯状细胞等都有受体高表达，宠物猫在病毒传播中的作用还需要深入研究，仅仅通过受体分布特征的数据还不能提供更多的证据。除了表达水平，后续要关注不同物种ACE2受体结构上的差异。

　　有研究提出44种哺乳类动物的ACE2可介导新冠病毒进入靶细胞，还发现了不同种类的猴子的反应都不太一样，如新世界猴ACE2不支持病毒进入细胞。这些数据提示高表达病毒受体的物种在病毒自然传播中的潜在作用。进一步仍要深入对ACE2关键功能位点的解析，更有助于我们认识新冠病毒的跨物种感染。

　　新冠病毒对人群是普遍易感的，怎么能更快找到感染的病人，也就是要采用什么检测方法？现有的检测技术包括检测病毒颗粒，检测病毒蛋白和遗传物质（核酸）以及检测病毒感染之后的反应。随着方法学上的不断改进，我们能够更快、更灵敏和特异的检测方法。

　　第一，病毒的分离，是病毒检测的金标准。用动物、培养的组织细胞培养、鸡胚等接种样本进行病毒的分离。但是病毒的分离是高技术依赖性，依赖于样本质量、病毒嗜细胞性以及分离体系，因此病毒分离是领域内重点发展的一个方向。新冠病毒可采用3D培养细胞系、非洲绿猴肾细胞（Vero和Vero E6）分离培养。

　　第二，血清学方法，包括中和试验、补体结合试验、红细胞凝集/抑制试验等，检测病毒蛋白和宿主感染后的病毒特异性抗体；现代发展的免疫学分析方法，包括酶联免疫和免疫荧光方法等，检测病毒抗原、IgM和IgG抗体等是对经典血清学方法的补充。这些方法具有较强特异性，但敏感性不足。其中，中和试验是判断病人是否产生能够中和病毒的抗体，需要使用活病毒，在生物安全III级实验室操作。

　　第三，分子生物学技术，新冠疫情让大家熟知的聚合酶链反应（PCR技术）就是常用的核酸分子生物学技术，此次病毒鉴定使用的高通量测序方法也是当前病原学检测上应用的技术。

　　这些检测方法各有优缺点，在方法学的使用上要根据实际情况选择。虽然我们做了很多年的病毒病原学研究，做了大量的核酸检测，但是做呼吸道病毒的核酸检测，既往在三甲级医院等医疗机构并没有实现常规检测。在当前常需要进行核酸大规模检测情况下，应高度关注核酸气溶胶污染，这对于实验室空间要求和个人技术能力等的要求很高。发展通量自动化核酸提取和检测平台，推进非核酸提取方法的封闭式的快速检测平台都是核酸检测方面亟待发展的内容。希望这次的新冠疫情能够作为一种助力，推动快速检测技术的发展。

　　病毒核酸检测要求检测引物（探针）序列与病毒基因组序列的匹配，新冠病毒的基因组为RNA，在自然演化和在群体免疫压力下是不断发生适应性突变。在国家基因组科学数据中心和国际多个数据网站上都可实时更新基因组突变情况。监测突变可以帮助我们去发现检测核酸的引物靶向基因区域是否发生突变，会不会容易产生脱靶的现象。毒株序列在其流行早期被分为S和L型，2020年1月7日前后，在武汉和非武汉地区S型别的分布呈现显著差异；经过全球近半年的流行适应，核蛋白基因R203K和G204R的突变株在全球多地出现；刺突蛋白基因D614G的突变株逐渐成为主要流行毒株，这一毒株被认为具有更快的传播能力。因此，对突变的监测不仅对检测方法的优化有重要作用，更是发现新的传播特性毒株、评估病毒流行特征的关键。

　　对突变的监测也可以从内突变分析角度来进行。群体中出现的突变病毒基因组，是病毒在个体内复制和群体间传播选择过程中逐渐形成的优势毒株。病毒中每复制一次，会产生0.01~0.0001个位点出现突变，这种突变与病毒聚合酶纠错功能不足和个体免疫压力的选择有关。因此，每个病内带有具有不同突变位点的基因组序列，称之为病毒准种。个体内不断选择形成的最有复制和传播优势的毒株逐渐形成了群体优势毒株。因此，对新冠病毒的宿主体内的突变监测，可有助于对群体流行株突变演化提供参考数据。

　　核酸检测并不是完美的，受到了很多因素的制约，如样本采集的质量、储存运输温度和检测灵敏度等，还受到不同感染病程的影响。基于。